O Myslivečkovom živote toho môžeme s istotou povedať pomerne málo a do značnej miery zostáva zahalený tajomstvom – dobových dokumentov a listov je v porovnaní s inými skladateľmi poskromne, o jeho osobnom živote v dospelosti nevieme prakticky nič. Takmer v úplnosti sa nám však zachovala jeho hudba, ktorá sa nám doteraz prihovára s nesmiernou silou a výrečnosťou.

Josef Mysliveček sa s najväčšou pravdepodobnosťou narodil v Sovových mlynoch na Kampe 9. marca 1737. Jeho otec bol zámožný a vplyvný mlynár Matěj Mysliveček. Aj Myslivečkova matka Anna Terézia pochádzala z mlynárskej rodiny. Okrem brata, dvojčaťa Jáchyma, mal Mysliveček ešte sestru Máriu Annu, ktorá v dospelosti vstúpila do kláštora. Jáchym sa až do smrti živil v Prahe ako mlynár.
 
S určitosťou vieme, že rodina bola zámožná a dobre zaopatrená. Myslivečkov otec kúpil okrem iného dom U Modrého šífu v Starom Meste (dnešná Melantrichova č. 13). Josef pravdepodobne navštevoval dominikánsku školu pri kostole sv. Egídia, kam zrejme dochádzal aj na lekcie hudby. Potom zrejme prešiel na jezuitskú školu v Klementine, kde sa kládol veľký dôraz na hudobnú prípravu študentov. Vieme, že sa zapísal na Karlo-Ferdinandovu univerzitu, ktorú však po prvom roku opustil, lebo „nedosiahol nijaký pokrok v logike“. Následne sa začal učiť za mlynára, kde študoval okrem iného hydrauliku a matematické predmety, ako sa od mlynárov vtedy vyžadovalo. Učenie úspešne dokončil, bol prijatý do pražského cechu ako mlynársky majster a začal pracovať v rodinných mlynoch.

Až do svojich dvadsiatich piatich rokov sa Mysliveček hudbe nijako sústredene nevenoval. Následne sa však náhle rozhodol zmeniť svoje životné plány a vydať sa na dráhu skladateľa a husľového virtuóza. Je možné, že ho v tomto rozhodnutí ovplyvnila aj skutočnosť, že v tom čase sa v Prahe po nútenej odmlke spôsobenej sedemročnou vojnou začali opäť uvádzať predstavenia talianskych opier, ktoré ho zrejme natoľko zaujali, že sa rozhodol sám sa v tomto žánri presadiť.

Najprv si doplnil hudobné vzdelanie v Prahe u Františka Václava Habermanna a Jozefa Segera. Prekvapivo rýchlo začal komponovať vlastné skladby – najstarším dochovaným dielom je vydarená Symfónia C dur. Talianske vzdelanie však bolo pre vtedajších operných skladateľov nevyhnutné a rovnako ako Mysliveček odišli do Talianska aj ďalší významní hudobníci pôvodom z českých krajín, napríklad Christoph Willibald Gluck, ktorý prežil detstvo a mladosť v Chřibskej pri Děčíne a na panstve Jezeří, či rodák z Mostu Florian Leopold Gassmann.

Mysliveček sa vybral do Talianska na jeseň roku 1763 s podporou významného mecenáša, grófa Vincenca z Valdštejna. Zamieril do Benátok, zrejme preto, že talianske opery, ktoré sa uvádzali v Prahe, a speváci, ktorí v nich účinkovali, často pochádzali práve z Benátok. V roku 1766, teda približne dva a pol roka po tom, ako prišiel do Benátok, sa v Bergame hrala jeho prvá opera Semiramide (Semiramis), ktorá sa stretla so značným úspechom a Myslivečkovi priniesla ďalšie príležitosti vrátane pozvania skomponovať operu pre Neapol.

Počas svojho pôsobenia v Taliansku Mysliveček cestoval z mesta do mesta, komponoval pre rôzne divadlá a nikdy neprijal stále miesto. Spojený bol najmä s neapolským divadlom Teatro San Carlo, čo bola najprestížnejšia európska scéna svojej doby, kde sa uvádzali talianske vážne opery. Práve v tomto významnom divadle sa uvádzalo viac Myslivečkových opier ako kdekoľvek inde. 

Myslivečkova prvá opera pre Neapol, Il Bellerofonte (Bellerofontés), sa stretla s nadšeným prijatím. V hlavných úlohách účinkovali tenorista Anton Raaff a sopranistka Caterina Gabrielli, dve z vtedajších najslávnejších operných hviezd, a Mysliveček s nimi často spolupracoval aj neskôr. K ďalším obľúbeným spolupracovníkom patril aj Luigi Marchesi, jeden z najobdivovanejších mužských sopranistov (kastrátov) tej doby. Vďaka priaznivému ohlasu opery nasledovali ďalšie zákazky pre celý rad talianskych divadiel vrátane Florencie, Ríma, Benátok, Turína a Bologne. 

Mysliveček dosiahol veľký úspech aj v Mníchove, kde sa v roku 1777 uvádzala jeho opera Ezio (Aetius) a tiež oratórium Isacco, figura del redentore (Izák, predobraz spasiteľa), o ktorom podľa listu Wolfganga Mozarta hovoril „celý Mníchov“ ešte aj o polroka neskôr. 

Mysliveček sa s Wolfgangom Mozartom a jeho otcom Leopoldom prvýkrát stretol v Bologni v roku 1770. V rokoch 1770 – 1778 sa Mysliveček spomína v dvadsatich ôsmich Mozartových zachovaných listoch, a aj toto značné množstvo korešpondencie zrejme predstavuje len zlomok. O skutočnom rozsahu osobných kontaktov i množstve listov sa môžeme len dohadovať.

V roku 1770 pracoval vtedy štrnásťročný Wolfgang Mozart na opere Mitridate, re di Ponto (Mitridates, pontský kráľ), ktorá sa mala uvádzať v Miláne. Mysliveček bol pre neho v tom čase významným mentorom, ktorý ho zoznámil s najnovšími trendmi v komponovaní talianskych vážnych opier. Mozartovho Mitridata môžeme bez preháňania opísať ako „myslivečkovské“ dielo a Mozart si pre svoju operu vypožičal množstvo hudobných nápadov z Myslivečkovej opery La Nitteti (Nittetis).

Naposledy sa Mysliveček a Wolfgang Mozart stretli v Mníchove, keď bol už Mysliveček vážne chorý a Mozart ho navštívil v nemocnici. O tomto stretnutí veľmi obsiahlo a dojemne píše v liste otcovi. Neskôr priateľstvo medzi Myslivečkom a Mozartovcami ochladlo, lebo Mysliveček nedokázal splniť svoj sľub a získať pre Wolfganga zákazku na operu pre Teatro San Carlo. 

Mozart sa k žánru vážnej opery znovu vrátil v závere svojho života, keď skomponoval operu La clemenza di Tito (Titova dobrotivosť), ktorá mala premiéru v pražskom Stavovskom divadle roku 1791 pri príležitosti korunovácie Leopolda II. českým kráľom. To isté libreto o sedemnásť rokov skôr zhudobnil aj Mysliveček.

V posledných rokoch života trpel Mysliveček veľkými zdravotnými problémami a bolesťami, spôsobenými postupujúcou chorobou, s najväčšou pravdepodobnosťou išlo o syfilis. Napriek tomu ďalej komponoval opery aj inštrumentálne skladby. Tri roky pred smrťou uviedol jednu zo svojich najlepších opier vôbec, L'Olimpiade, ktorá sa hrala na počesť sviatku španielskeho kráľa. Jeden z dobových komentárov k nej uvádza: Slávna ária „Se cerca, se dice“, najmä druhá časť „Che abisso di pene, lasciare il suo bene“, vyvolala úžas hraničiaci s búrlivým nadšením. Myslivečkovo zhudobnenie tejto árie je skutočne majstrovské dielo nanajvýš nádherného a výrečného vokálneho štýlu a používa úplne nový a veľmi zložitý doprovod.  

Okrem choroby Myslivečka postihla aj hmotná núdza a musel sa uchýliť k niekoľkým pôžičkám v banke pre chudobných. Nie je známe, kedy presne zomrel, ale zachoval sa záznam o pohrebe, ktorý sa konal v Ríme v kostole San Lorenzo in Lucina 4. februára 1781. Tento dátum bol čoskoro prijatý ako deň jeho smrti. Nezostal po ňom prakticky nijaký majetok a kňaz, ktorý zaznamenal jeho pohreb, pokladal Myslivečka za šesťdesiatpäťročného muža, zatiaľ čo v skutočnosti skladateľ nedosiahol ani štyridsaťštyri rokov.

Zostavené na základe knihy Daniela E. Freemana Il boemo: průvodce po životě a díle Josefa Myslivečka (Vyšehrad, 2021).